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我(wo)校華西生物國重室蘇昭銘團隊在Nature發(fa)文 首次揭示3.1 ?全長四膜(mo)蟲核(he)酶冷凍(dong)電鏡(jing)結構(gou)

發布時間(jian) :2021年08月12日 來(lai)源(yuan) :向日葵承认(ren)视频app下载華西醫院(yuan)生物(wu)治療國家重點實驗室(shi) 編(bian)輯 :王彥(yan)東 瀏(liu)覽量(liang) :

RNA具有重要的生物學功能,很多非編碼RNA可以折疊成復雜的三維結構以行使或參與重要的生命過程,如催化、轉錄和翻譯調控等。但由于RNA三維結構信息的匱乏,導致目前對RNA三維結構與功能間關系的認知仍相對有限。冷凍電鏡現已成為生物大分子結構解析不可或缺的技術,然而由于RNA結構本身較強的不均一性,因此純RNA冷凍電鏡高分辨結構的獲得依然是很大的挑戰。此前,冷凍電鏡數據庫中僅有不到10個分辨率優于5 ?的純RNA結構,最高分辨率是3.7 ?。

四(si)膜(mo)蟲I類自(zi)剪(jian)接內含(han)子(Tetrahymena group I self-splicing intron)是由美國(guo)科學家Tom Cech發現(xian)的(de)(de)首個在(zai)沒有蛋白參與(yu)情況下具備酶(mei)催化(hua)活(huo)性的(de)(de)RNA,隨(sui)后被命名為核(he)(he)酶(mei)(ribozyme),Tom Cech也(ye)因(yin)為這個發現(xian)獲(huo)得了(le)(le)1989年的(de)(de)諾(nuo)貝爾化(hua)學獎。四(si)膜(mo)蟲核(he)(he)酶(mei)的(de)(de)核(he)(he)心(xin)區域P3-P9具有非(fei)常緊湊(cou)的(de)(de)三維(wei)結(jie)構來形(xing)成酶(mei)催化(hua)位(wei)點,它也(ye)成為了(le)(le)研究(jiu)RNA三維(wei)結(jie)構與(yu)催化(hua)功能關系(xi)的(de)(de)重要模型。

圖1. 四膜蟲核(he)酶holo狀態(tai)結合底物后進行(xing)催化反應。5’ 外(wai)顯子(黃色(se))和3’ 外(wai)顯子(橙色(se))在(zai)核(he)酶的作用下(xia)連接形成(cheng)外(wai)顯子并最(zui)終離開四膜蟲核(he)酶。

8月11日,向日葵承认视频app下载華西醫院生物治療國家重點實驗室蘇昭銘團隊,聯合美國斯坦福大學Wah Chiu和Rhiju Das團隊,共同在Nature雜志上在線發表了最新研究成果“Cryo-EM Structures of Full-Length Tetrahymena Ribozyme at 3.1 ? Resolution”。該研究采用單顆粒冷凍電鏡技術首次解析了全長四膜蟲核酶在無底物結合狀態(apo)和底物結合狀態(holo)的高分辨結構(圖1)。

“雖(sui)然Tom Cech之前(qian)解(jie)析了P3-P9區(qu)域3.8 ?的晶體結(jie)構,但包(bao)含周邊區(qu)域的完(wan)整全長結(jie)構仍舊(jiu)未知,這極大限制了人(ren)們了解(jie)四膜蟲(chong)(chong)核酶周邊區(qu)域如(ru)何(he)遠程調控核酶活性的結(jie)構機制。此外,3.8 ?的分(fen)辨率(lv)也(ye)不足以鑒(jian)別出很多參(can)與催(cui)化反應的關鍵金屬離子。”本研究第一和共同(tong)通訊(xun)作者(zhe)蘇昭銘(ming)研究員說道,“因此,解(jie)析四膜蟲(chong)(chong)核酶的完(wan)整結(jie)構對(dui)于研究其結(jie)構功能(neng)(neng)關系尤為重要,同(tong)時對(dui)運用冷凍電鏡研究其他RNA的結(jie)構與功能(neng)(neng)都具有重要參(can)考意(yi)義。”

本研究(jiu)通(tong)過解析四膜蟲核酶的高(gao)分辨冷凍(dong)電鏡結構(gou),對不同結構(gou)域間的互作(zuo)關系進行(xing)了深度解析,具體發現如下:

(1)首先揭(jie)示了(le)(le)apo狀態下L-21 ScaI核(he)酶(mei)的(de)3.1 ?全長冷(leng)凍電鏡結(jie)構,這(zhe)也是目前(qian)分辨率(lv)最高的(de)純RNA冷(leng)凍電鏡結(jie)構。該結(jie)構首次解(jie)析(xi)了(le)(le)外(wai)圍(wei)區域(yu)結(jie)構并揭(jie)示了(le)(le)其與核(he)心區域(yu)P3-P9間幾(ji)個(ge)重(zhong)要的(de)長程(cheng)相互作用。外(wai)圍(wei)區域(yu)P2、P2.1、P9.1、P9.2通過形(xing)成兩個(ge)假(jia)結(jie)結(jie)構(Pseudoknot)P13和P14,以及P14中(zhong)的(de)U43-A171-A172和P2-P2.1連接處(chu)的(de)A31-U56-A95兩個(ge)堿基三鏈體(Base triple),將P3-P9包圍(wei)起來。

(2)發(fa)現了兩(liang)種(zhong)(zhong)“始料未及(ji)”的(de)長(chang)(chang)(chang)程相(xiang)互作(zuo)用。第一,P4螺旋中(zhong)(zhong)的(de)核苷酸A210與P2中(zhong)(zhong)的(de)A46之間形成(cheng)氫鍵,并與P14中(zhong)(zhong)的(de)G169形成(cheng)一個堿基(ji)堆疊(stacking),這樣的(de)互作(zuo)方式使三者之間形成(cheng)一個“P2-P4-P14橋”的(de)結(jie)(jie)(jie)構。之前的(de)研究發(fa)現A210會降低四(si)膜蟲(chong)核酶的(de)結(jie)(jie)(jie)構穩(wen)(wen)定性,但對全長(chang)(chang)(chang)核酶的(de)活性卻至(zhi)關重要(yao),這一長(chang)(chang)(chang)程相(xiang)互作(zuo)用為(wei)該結(jie)(jie)(jie)果做(zuo)出了合理(li)的(de)解釋。第二,P9.1中(zhong)(zhong)富(fu)含嘌呤的(de)內環(bulge)G358、A359、G360可(ke)以(yi)與催化(hua)核心P7間形成(cheng)“P7多嘌呤長(chang)(chang)(chang)程相(xiang)互作(zuo)用”(P7 purine-rich interaction)以(yi)穩(wen)(wen)定酶活位點的(de)結(jie)(jie)(jie)構。以(yi)上兩(liang)種(zhong)(zhong)結(jie)(jie)(jie)構發(fa)現展示了全新的(de)外圍(wei)區(qu)域(yu)與核心區(qu)域(yu)間互作(zuo)的(de)方式,說明了外圍(wei)區(qu)域(yu)如何(he)對酶活位點造成(cheng)影響。

(3)通過比較核(he)酶結合(he)5’ 和3’ 外(wai)顯子(zi)底(di)物(wu)(wu)的(de)(de)holo狀(zhuang)態(tai)(tai)與apo狀(zhuang)態(tai)(tai)的(de)(de)結構,揭示了通過互補配對(dui)結合(he)底(di)物(wu)(wu)的(de)(de)內(nei)部引導(dao)序列(Interna guide sequence,IGS)的(de)(de)構象重排,以及酶活位(wei)點的(de)(de)構象變化。與底(di)物(wu)(wu)結合(he)后,IGS區向(xiang)催化核(he)心的(de)(de)方向(xiang)發生(sheng)了約60°的(de)(de)構象旋(xuan)轉,同時酶活位(wei)點中的(de)(de)堿基和金屬(shu)離子(zi)也發生(sheng)了一定程(cheng)度的(de)(de)位(wei)移,雖然活性位(wei)點的(de)(de)大致結構在apo狀(zhuang)態(tai)(tai)下就已基本形成。

(4)在holo狀態的(de)(de)核酶(mei)中(zhong)共鑒(jian)定(ding)出31個金(jin)屬離(li)子(M1~M31)。有些金(jin)屬離(li)子直(zhi)接調控核酶(mei)的(de)(de)催化活性(xing),其中(zhong)包括先前通過生化功能實驗鑒(jian)定(ding)出直(zhi)接參與酶(mei)活反應(ying)的(de)(de)MA(M26)和MC(M27)、遠程(cheng)調控酶(mei)活的(de)(de)ME(M28)以(yi)及(ji)新發現的(de)(de)穩定(ding)酶(mei)活位點的(de)(de)M2。由于(yu)金(jin)屬離(li)子,尤其是鎂離(li)子,對(dui)RNA的(de)(de)正確折疊以(yi)及(ji)功能活性(xing)都(dou)起到了(le)至關重要的(de)(de)作用,所以(yi)該研(yan)(yan)究也揭示了(le)運用冷凍電鏡研(yan)(yan)究RNA結構和功能的(de)(de)優勢(shi)。

綜上所述,該研究利用單顆粒冷(leng)(leng)凍電鏡技術揭(jie)示了(le)四(si)膜蟲(chong)核酶的(de)全長高分(fen)辨三維(wei)結構(gou),闡(chan)明了(le)在(zai)底(di)物結合(he)和催化(hua)過程中IGS、金屬離(li)子(zi)、磷酸基(ji)團與堿基(ji)的(de)構(gou)象變化(hua),為長達40年(nian)來對四(si)膜蟲(chong)核酶剪接反應的(de)研究提供了(le)結構(gou)和機制上的(de)支持(chi),同時也為后續(xu)進(jin)行(xing)高分(fen)辨RNA冷(leng)(leng)凍電鏡結構(gou)的(de)研究提供了(le)范式。

向日(ri)葵承(cheng)(cheng)认(ren)视频(pin)app下(xia)载華(hua)(hua)西(xi)醫(yi)院生物治(zhi)療國家重點實驗(yan)室、華(hua)(hua)西(xi)醫(yi)院老年科(ke)與(yu)國家老年疾(ji)病臨床醫(yi)學研(yan)(yan)(yan)(yan)究中心為本(ben)研(yan)(yan)(yan)(yan)究的第一完成單位和通訊(xun)(xun)單位。蘇(su)昭銘(ming)研(yan)(yan)(yan)(yan)究員為本(ben)研(yan)(yan)(yan)(yan)究第一和共同通訊(xun)(xun)作者,中國科(ke)技(ji)大學張凱(kai)銘(ming)研(yan)(yan)(yan)(yan)究員和斯(si)坦福大學Kalli Kappel博(bo)士為共同一作。向日(ri)葵承(cheng)(cheng)认(ren)视频(pin)app下(xia)载華(hua)(hua)西(xi)生物國重室冷凍電鏡中心工程師羅炳(bing)男參(can)與(yu)了(le)數據處理分(fen)析工作。同時,本(ben)研(yan)(yan)(yan)(yan)究得到了(le)魏于全院士的大力支持。本(ben)研(yan)(yan)(yan)(yan)究由(you)向日(ri)葵承(cheng)(cheng)认(ren)视频(pin)app下(xia)载海(hai)外引進人才啟(qi)動(dong)經費和國家自(zi)然科(ke)學基金等項目(mu)資助(zhu)完成。

向日葵承认视频app下载華西(xi)生物國(guo)重(zhong)室冷(leng)凍電(dian)鏡(jing)(jing)中心擁有300和(he)200千(qian)伏前沿(yan)冷(leng)凍電(dian)鏡(jing)(jing)各一臺,同時配備了光電(dian)聯用(CLEM)系統,可(ke)以進行高分(fen)辨單顆(ke)粒重(zhong)構(gou)、斷層(ceng)成(cheng)像(Cryo-ET)、微晶(jing)衍射(MicroED)等數據收集,現長期招聘具有一定電(dian)鏡(jing)(jing)操作(zuo)(zuo)經驗(yan)的工作(zuo)(zuo)人(ren)員;蘇昭銘課題組的研究興趣是運(yun)用冷(leng)凍電(dian)鏡(jing)(jing)揭示病原RNA和(he)RNA蛋白復合物的結構(gou)和(he)功能,并基于RNA結構(gou)設計和(he)篩選(xuan)RNA靶向小分(fen)子化合物,作(zuo)(zuo)為潛在的分(fen)子探針和(he)候(hou)選(xuan)藥物。