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我校華西生(sheng)物國(guo)重室(shi)蘇昭銘團隊(dui)在Nature發文 首次揭示3.1 ?全長四(si)膜(mo)蟲核酶冷(leng)凍電鏡結構

發布時間 :2021年(nian)08月(yue)12日 來(lai)源(yuan) :向日(ri)葵承认视频app下载(zai)華(hua)西醫院生物治療國家重(zhong)點(dian)實驗(yan)室 編輯 :王彥東

RNA具有重要的生物學功能,很多非編碼RNA可以折疊成復雜的三維結構以行使或參與重要的生命過程,如催化、轉錄和翻譯調控等。但由于RNA三維結構信息的匱乏,導致目前對RNA三維結構與功能間關系的認知仍相對有限。冷凍電鏡現已成為生物大分子結構解析不可或缺的技術,然而由于RNA結構本身較強的不均一性,因此純RNA冷凍電鏡高分辨結構的獲得依然是很大的挑戰。此前,冷凍電鏡數據庫中僅有不到10個分辨率優于5 ?的純RNA結構,最高分辨率是3.7 ?。

四膜蟲(chong)I類自剪接內含子(Tetrahymena group I self-splicing intron)是由美(mei)國科學家Tom Cech發(fa)(fa)現(xian)的(de)首(shou)個(ge)在沒有(you)蛋白參與(yu)情況下具備酶(mei)(mei)催(cui)化(hua)活性的(de)RNA,隨后被(bei)命名為(wei)(wei)核(he)酶(mei)(mei)(ribozyme),Tom Cech也因為(wei)(wei)這個(ge)發(fa)(fa)現(xian)獲得了(le)1989年的(de)諾(nuo)貝爾(er)化(hua)學獎。四膜蟲(chong)核(he)酶(mei)(mei)的(de)核(he)心區(qu)域P3-P9具有(you)非常(chang)緊湊的(de)三維(wei)結(jie)構來形成酶(mei)(mei)催(cui)化(hua)位點,它也成為(wei)(wei)了(le)研究RNA三維(wei)結(jie)構與(yu)催(cui)化(hua)功(gong)能關系(xi)的(de)重要模型。

圖1. 四膜蟲核酶holo狀態結(jie)合底(di)物后進行催化(hua)反應。5’ 外(wai)顯子(zi)(zi)(黃色(se)(se))和(he)3’ 外(wai)顯子(zi)(zi)(橙色(se)(se))在核酶的(de)作用下連接形成外(wai)顯子(zi)(zi)并最終離開四膜蟲核酶。

8月11日,向日葵承认视频app下载華西醫院生物治療國家重點實驗室蘇昭銘團隊,聯合美國斯坦福大學Wah Chiu和Rhiju Das團隊,共同在Nature雜志上在線發表了最新研究成果“Cryo-EM Structures of Full-Length Tetrahymena Ribozyme at 3.1 ? Resolution”。該研究采用單顆粒冷凍電鏡技術首次解析了全長四膜蟲核酶在無底物結合狀態(apo)和底物結合狀態(holo)的高分辨結構(圖1)。

“雖然Tom Cech之(zhi)前解(jie)(jie)析了(le)P3-P9區(qu)域3.8 ?的(de)(de)晶體(ti)結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou),但包含(han)周(zhou)邊(bian)區(qu)域的(de)(de)完(wan)整(zheng)全長結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)仍舊(jiu)未知,這極大限制(zhi)了(le)人們(men)了(le)解(jie)(jie)四膜(mo)蟲(chong)核酶周(zhou)邊(bian)區(qu)域如(ru)何遠程調(diao)控核酶活性(xing)的(de)(de)結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)機制(zhi)。此外(wai),3.8 ?的(de)(de)分辨率也不足以鑒別出(chu)很多參(can)與(yu)催化反應的(de)(de)關(guan)鍵(jian)金屬(shu)離子。”本研究第一和(he)共同通訊作者蘇昭(zhao)銘研究員說道,“因此,解(jie)(jie)析四膜(mo)蟲(chong)核酶的(de)(de)完(wan)整(zheng)結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)對(dui)于研究其結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)功(gong)能關(guan)系尤為重(zhong)要(yao)(yao),同時對(dui)運用冷凍(dong)電鏡(jing)研究其他RNA的(de)(de)結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)與(yu)功(gong)能都(dou)具有(you)重(zhong)要(yao)(yao)參(can)考(kao)意義。”

本研究通過解(jie)析(xi)四膜(mo)蟲核(he)酶的高分辨冷凍電鏡結構,對不同(tong)結構域(yu)間的互作關系進(jin)行了深度解(jie)析(xi),具(ju)體發現如下:

(1)首先揭(jie)示了apo狀(zhuang)態下L-21 ScaI核(he)酶的(de)(de)3.1 ?全長冷凍電鏡結構(gou)(gou),這(zhe)也是目前分辨率最高的(de)(de)純(chun)RNA冷凍電鏡結構(gou)(gou)。該結構(gou)(gou)首次解析(xi)了外圍區域(yu)結構(gou)(gou)并揭(jie)示了其與核(he)心(xin)區域(yu)P3-P9間(jian)幾個(ge)重要的(de)(de)長程相互作用。外圍區域(yu)P2、P2.1、P9.1、P9.2通(tong)過形成兩(liang)個(ge)假結結構(gou)(gou)(Pseudoknot)P13和P14,以及P14中(zhong)的(de)(de)U43-A171-A172和P2-P2.1連接處的(de)(de)A31-U56-A95兩(liang)個(ge)堿基三鏈(lian)體(Base triple),將P3-P9包圍起(qi)來。

(2)發現(xian)了兩種“始料未及”的(de)(de)(de)長(chang)(chang)程(cheng)相(xiang)互作(zuo)用(yong)。第一(yi)(yi),P4螺旋中的(de)(de)(de)核苷酸A210與(yu)P2中的(de)(de)(de)A46之間(jian)形成(cheng)氫鍵,并(bing)與(yu)P14中的(de)(de)(de)G169形成(cheng)一(yi)(yi)個堿(jian)基(ji)堆疊(stacking),這樣(yang)的(de)(de)(de)互作(zuo)方式(shi)使(shi)三者之間(jian)形成(cheng)一(yi)(yi)個“P2-P4-P14橋”的(de)(de)(de)結構(gou)。之前的(de)(de)(de)研究(jiu)發現(xian)A210會降低四(si)膜(mo)蟲核酶(mei)的(de)(de)(de)結構(gou)穩定性,但對全長(chang)(chang)核酶(mei)的(de)(de)(de)活(huo)(huo)性卻至(zhi)關重要,這一(yi)(yi)長(chang)(chang)程(cheng)相(xiang)互作(zuo)用(yong)為該結果做出了合理的(de)(de)(de)解釋。第二,P9.1中富含嘌呤的(de)(de)(de)內環(bulge)G358、A359、G360可以與(yu)催化(hua)核心(xin)P7間(jian)形成(cheng)“P7多(duo)嘌呤長(chang)(chang)程(cheng)相(xiang)互作(zuo)用(yong)”(P7 purine-rich interaction)以穩定酶(mei)活(huo)(huo)位點的(de)(de)(de)結構(gou)。以上(shang)兩種結構(gou)發現(xian)展示了全新的(de)(de)(de)外(wai)圍區域(yu)(yu)與(yu)核心(xin)區域(yu)(yu)間(jian)互作(zuo)的(de)(de)(de)方式(shi),說明了外(wai)圍區域(yu)(yu)如何對酶(mei)活(huo)(huo)位點造成(cheng)影響(xiang)。

(3)通過比較核(he)酶(mei)結(jie)合(he)5’ 和3’ 外顯子底物(wu)的(de)(de)holo狀態(tai)(tai)與(yu)apo狀態(tai)(tai)的(de)(de)結(jie)構(gou)(gou),揭(jie)示了通過互補配(pei)對結(jie)合(he)底物(wu)的(de)(de)內部引導序列(Interna guide sequence,IGS)的(de)(de)構(gou)(gou)象重排,以及酶(mei)活(huo)位(wei)(wei)點的(de)(de)構(gou)(gou)象變化。與(yu)底物(wu)結(jie)合(he)后,IGS區(qu)向催化核(he)心的(de)(de)方向發(fa)生了約60°的(de)(de)構(gou)(gou)象旋轉,同時酶(mei)活(huo)位(wei)(wei)點中的(de)(de)堿基和金屬離(li)子也發(fa)生了一(yi)定(ding)程(cheng)度的(de)(de)位(wei)(wei)移(yi),雖(sui)然活(huo)性位(wei)(wei)點的(de)(de)大致(zhi)結(jie)構(gou)(gou)在apo狀態(tai)(tai)下就已基本形成。

(4)在holo狀(zhuang)態(tai)的(de)(de)(de)核(he)酶(mei)(mei)中(zhong)共鑒定出(chu)31個金(jin)屬離(li)子(zi)(zi)(zi)(M1~M31)。有些金(jin)屬離(li)子(zi)(zi)(zi)直接調控(kong)核(he)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)催化活(huo)性,其中(zhong)包括(kuo)先前通過生化功(gong)能實驗鑒定出(chu)直接參與(yu)酶(mei)(mei)活(huo)反應的(de)(de)(de)MA(M26)和(he)MC(M27)、遠程調控(kong)酶(mei)(mei)活(huo)的(de)(de)(de)ME(M28)以及新(xin)發(fa)現的(de)(de)(de)穩定酶(mei)(mei)活(huo)位點(dian)的(de)(de)(de)M2。由于金(jin)屬離(li)子(zi)(zi)(zi),尤其是鎂離(li)子(zi)(zi)(zi),對RNA的(de)(de)(de)正確折疊以及功(gong)能活(huo)性都(dou)起到了至關重要的(de)(de)(de)作用,所以該研(yan)(yan)究也揭(jie)示了運用冷(leng)凍電鏡研(yan)(yan)究RNA結構和(he)功(gong)能的(de)(de)(de)優勢。

綜上所述,該研(yan)究利用單顆粒冷凍電鏡技(ji)術揭示了四膜(mo)蟲核酶(mei)的(de)全長高(gao)分辨(bian)三(san)維結構(gou)(gou),闡(chan)明了在底(di)物結合和(he)(he)催化過程中IGS、金屬(shu)離子、磷(lin)酸基團(tuan)與堿(jian)基的(de)構(gou)(gou)象變(bian)化,為長達(da)40年來對(dui)四膜(mo)蟲核酶(mei)剪接反應(ying)的(de)研(yan)究提供了結構(gou)(gou)和(he)(he)機制上的(de)支持(chi),同(tong)時也為后續進行(xing)高(gao)分辨(bian)RNA冷凍電鏡結構(gou)(gou)的(de)研(yan)究提供了范式。

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